【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】華中科技大學(xué)袁菁教授、海南大學(xué)駱清銘院士團(tuán)隊(duì)發(fā)明了一種數(shù)字陣列調(diào)制顯微鏡(DaMo)，實(shí)現(xiàn)橫向分辨率100 nm，軸向分辨率300 nm的無偽影、高質(zhì)量、高通量三維超分辨成像。該方法照明調(diào)制對(duì)比度拉至100%，圖像保真度達(dá)到99±1%，重建速度提升了100倍，信背比提升了3個(gè)數(shù)量級(jí)。3月26日，研究成果以 “Threedimensional superresolution imaging with suppressed background via digital array modulation microscopy”為題發(fā)表在Nature Photonics上。
 

　　武漢光電國(guó)家研究中心李思潔博士生與金銳博士為并列第一作者，袁菁教授與駱清銘院士為并列通訊作者。魯夢(mèng)琦碩士生、張朦博士、魏云飛博士、張湛博士生、郭詩睿博士生、張玉慧教授、龔輝教授以及陸軍軍醫(yī)大學(xué)張寧博士、王鋒超教授為共同作者。
 

　　光學(xué)顯微鏡自誕生以來，一直是生命科學(xué)研究的重要工具。然而，衍射極限長(zhǎng)久以來如同“緊箍咒”，束縛著科學(xué)家對(duì)納米尺度世界的探索。超分辨成像技術(shù)的出現(xiàn)打破了這一桎梏，其中超分辨結(jié)構(gòu)光照明顯微鏡(SR-SIM)憑借其優(yōu)異的標(biāo)記兼容性，成為解析細(xì)胞器變化機(jī)制的利器。SR-SIM的核心思路是利用結(jié)構(gòu)化照明對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行調(diào)制，借助莫爾效應(yīng)將樣品中原本不可見的高頻細(xì)節(jié)信息搬移到顯微鏡能夠探測(cè)到的范圍內(nèi)，再通過Wiener重建算法還原出一張分辨率比傳統(tǒng)顯微鏡提升一倍的超分辨圖像。
 

　　然而，自2000年問世以來，SR-SIM在重建圖像時(shí)易產(chǎn)生偽影、保真度不高的問題便如影隨形，成為該技術(shù)領(lǐng)域久攻不下的核心痛點(diǎn)。造成這一問題的根本原因在于，傳統(tǒng)方法采用的寬場(chǎng)成像光路在面對(duì)存在強(qiáng)烈背景干擾的非理想生物樣本時(shí)，很難有效抵抗噪聲和離焦背景的干擾。離焦背景與噪聲的存在，在頻域重建過程中易被放大，引入嚴(yán)重的重建偽影，損害圖像真實(shí)度與分辨率。現(xiàn)有方案多依賴于復(fù)雜的數(shù)據(jù)后處理來彌補(bǔ)這一缺陷，但這種“先污染后治理”的思路無法從根本上消除重建偽影來源，反而使計(jì)算流程變得復(fù)雜冗長(zhǎng)，且后處理帶來的改善往往有限，甚至可能引入不真實(shí)的圖像特征，嚴(yán)重限制了其在復(fù)雜生物樣本中的廣泛應(yīng)用。
 

　　研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中建立了一種全新的離軸成像框架。不同于傳統(tǒng)落射式照明成像中照明軸與探測(cè)軸共軸的方式，離軸成像框架采用照明與探測(cè)軸分離的成像策略。在該框架下，聚焦光斑形成天然的照明調(diào)制，陣列探測(cè)器捕獲其完整的空間分布，在像素層面建立起一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。由此，每個(gè)探測(cè)器像素都與一個(gè)特定的照明子區(qū)域形成共軛，以固有的離軸方式記錄其獨(dú)特調(diào)制的信號(hào)。在掃描成像過程中，樣本點(diǎn)依次通過各照明子區(qū)域，使得單次掃描即可獲取時(shí)間復(fù)用且空間編碼的原始數(shù)據(jù)集，直接支撐了新型成像方法的靈活開發(fā)。DaMo正是這一框架下的集大成之作。
 

　　DaMo徹底跳出了傳統(tǒng)SR-SIM的固有范式，通過對(duì)天然高斯照明疊加虛擬陣列調(diào)制，將正弦調(diào)制的對(duì)比度提升至100%，并基于厄米特對(duì)稱性提出了單頻譜重建算法，將重建速度提升兩個(gè)數(shù)量級(jí)，信背比提升3個(gè)數(shù)量級(jí)，實(shí)現(xiàn)了橫向100納米、軸向300納米的三維分辨率。
 

　　核心創(chuàng)新亮點(diǎn)：第一，調(diào)制對(duì)比度提升至100%，從源頭消除了重建偽影。傳統(tǒng)SR-SIM采用零差探測(cè)成像，直接記錄正弦調(diào)制的熒光圖像，調(diào)制對(duì)比度的理論上限僅為50%，在實(shí)際應(yīng)用中還極易受噪聲和背景干擾而進(jìn)一步下降。DaMo利用線照明的天然高斯分布，結(jié)合陣列探測(cè)器的數(shù)字調(diào)制，實(shí)現(xiàn)了無需物理器件的100%高頻對(duì)比度外差探測(cè)成像。該設(shè)計(jì)將能量最大化分配至高頻分量，同時(shí)借助線照明的共聚焦效應(yīng)，從物理底層有效抑制了離焦背景，徹底解決了傳統(tǒng)方法因噪聲和背景干擾而產(chǎn)生的重建偽影問題。第二，重建算法極致簡(jiǎn)化，保真度達(dá)99%，計(jì)算速度提升兩個(gè)數(shù)量級(jí)。傳統(tǒng)SR-SIM采用全頻譜重建，計(jì)算過程復(fù)雜且耗時(shí)。DaMo獨(dú)創(chuàng)的單頻譜重建算法，首次利用厄米特對(duì)稱性將原本復(fù)雜的重建過程簡(jiǎn)化為線性計(jì)算，同時(shí)僅使用高級(jí)次頻譜參與重建，進(jìn)一步增強(qiáng)了對(duì)背景干擾的抑制效果。該算法不僅使重建速度提升兩個(gè)數(shù)量級(jí)，能夠在成像的同時(shí)完成圖像重建，更實(shí)現(xiàn)了99±1%的圖像保真度，確保了成像結(jié)果的真實(shí)可靠。得益于上述技術(shù)創(chuàng)新，DaMo僅憑橫向調(diào)制便同時(shí)打破了橫向和軸向的衍射極限，無需任何計(jì)算增強(qiáng)處理，即為復(fù)雜生物體系的觀測(cè)提供了真正無偽影、高質(zhì)量、高通量的三維超分辨成像手段。
 

　　DaMo的顛覆性不止于技術(shù)參數(shù)，更在于其強(qiáng)大的生物學(xué)應(yīng)用潛力。研究團(tuán)隊(duì)通過一系列實(shí)驗(yàn)，充分展示了這一新方法的獨(dú)特價(jià)值。
 

　　活細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的超分辨成像一直頗具挑戰(zhàn)，傳統(tǒng)方法難以將微弱的肌動(dòng)蛋白信號(hào)與噪聲分離。得益于其超高的圖像質(zhì)量，DaMo成功實(shí)現(xiàn)了對(duì)U2OS活細(xì)胞中肌動(dòng)蛋白的時(shí)序記錄，首次觀察到絲狀偽足延伸并級(jí)聯(lián)融合的動(dòng)態(tài)過程。這些結(jié)果充分展現(xiàn)了DaMo解析關(guān)鍵細(xì)胞過程中肌動(dòng)蛋白時(shí)空動(dòng)態(tài)的能力。此外，DaMo還具有較低的光毒性，在連續(xù)拍攝千余幀后細(xì)胞仍能保持活性。
 

　　傳統(tǒng)細(xì)胞器動(dòng)態(tài)研究多依賴單細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)程觀察，需在形態(tài)細(xì)節(jié)與群體統(tǒng)計(jì)效力之間權(quán)衡，存在采樣廣度、時(shí)間穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)成本等方面的局限。為此，該研究提出了一種全新的高內(nèi)涵分析途徑，通過對(duì)非同步化細(xì)胞進(jìn)行全涂片快照式成像，無差別地獲取各階段具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的形態(tài)學(xué)特征，從而實(shí)現(xiàn)高效的周期分析。DaMo用20分鐘完成了全涂片萬余個(gè)U2OS細(xì)胞的三色超分辨成像與同步重建，清晰揭示了從紡錘體形成、染色體分離到新細(xì)胞形成的完整有絲分裂過程。
 

　　組織切片的背景噪聲更強(qiáng)，整體空間異質(zhì)性更復(fù)雜，對(duì)傳統(tǒng)超分辨成像技術(shù)構(gòu)成了較大挑戰(zhàn)。而DaMo憑借其高質(zhì)量、高通量的特性，有效突破了這一瓶頸。該工作展示了DaMo對(duì)10毫米見方小鼠小腸完整冰凍切片的三通道超分辨成像結(jié)果，實(shí)現(xiàn)了1.92 TB原始數(shù)據(jù)的高效采集與在線重建。在此基礎(chǔ)上，該工作還對(duì)小鼠小腸炎癥模型下不同腸段、不同部位的線粒體病變進(jìn)行了定量統(tǒng)計(jì)與分析，充分展現(xiàn)了DaMo在組織水平實(shí)現(xiàn)跨尺度、高保真超分辨成像的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。
 

　　DaMo的問世，為超分辨成像領(lǐng)域提供了一種兼顧分辨率、通量、信背比與普適性的三維成像新范式。它以軟硬件協(xié)同優(yōu)化為核心，實(shí)現(xiàn)了無需復(fù)雜調(diào)制器件、無需圖像后處理增強(qiáng)的純凈成像路徑，打通了從亞細(xì)胞器到組織架構(gòu)的跨尺度觀測(cè)鏈路。無論是活細(xì)胞、全細(xì)胞涂片，還是完整組織切片，該方法都展現(xiàn)出了出色的成像能力。這為生物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究與臨床診斷帶來了全新的可能，也讓高內(nèi)涵超分辨成像分析有望在更多科學(xué)議題中大顯身手。