血液分子生物學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)主要包括PCR技術(shù)、DNA測序技術(shù)、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、轉(zhuǎn)基因技術(shù)及基因芯片（DNA-chip）技術(shù)等分子生物學(xué)技術(shù)。目前這些技術(shù)已應(yīng)用于血液病基因分析、基因診斷、白血病分型、指導(dǎo)治療、判斷預(yù)后和微小殘留病檢測等方面。

（1）核酸分子雜交技術(shù)原理和方法

1）Southern印跡雜交

2）Northern印跡雜交

3）核酸原位雜交

（2）聚合酶鏈反應(yīng)原理和常用PCR產(chǎn)物檢查方法

聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）技術(shù)于1985年由美國Mullis等建立。PCR技術(shù)使體外擴(kuò)增核酸片段成為可能，使人們能夠在幾小時(shí)內(nèi)從試管中獲得大量特異核酸片段。由于核酸是生物體儲存和傳遞遺傳信息的載體，因此能夠迅速獲得大量特異核酸片段的PCR技術(shù)給生命科學(xué)各個(gè)領(lǐng)域的研究手段帶來了革命性的變化。該技術(shù)已經(jīng)與DNA克隆、DNA重組和DNA測序等技術(shù)一樣成為血液分子生物學(xué)一項(xiàng)*的工具。
1）PCR產(chǎn)物檢測

①瓊脂糖凝膠電泳

②Southern印跡雜交

③斑點(diǎn)雜交法

④PCR-ELISA法

⑤原位雜交法

（3）以PCR為基礎(chǔ)的相關(guān)技術(shù)

近年來PCR技術(shù)在應(yīng)用的過程中得到了進(jìn)一步的發(fā)展。目前已出現(xiàn)多種以PCR為基礎(chǔ)的PCR相關(guān)技術(shù)，形成了適用于不同目的的PCR技術(shù)系列，以下是幾種在血液學(xué)及檢驗(yàn)領(lǐng)域應(yīng)用較多的PCR相關(guān)技術(shù)。

1）逆轉(zhuǎn)錄PCR

逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription PCR，RT-PCR）是以細(xì)胞內(nèi)總RNA或mRNA為材料進(jìn)行的體外擴(kuò)增技術(shù)。由于耐熱的DNA聚合酶不能以RNA或mRNA作為模板，因此必須先將總RNA或mRNA作逆轉(zhuǎn)錄，生成與之互補(bǔ)的cDNA，然后再以cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到所需要的目的基因片段。RT-PCR常用于克隆cDNA、合成cDNA探針以及分析基因表達(dá)等。

2）定量PCR

zui初的PCR技術(shù)只是用于定性檢測DNA或RNA，對PCR產(chǎn)物的數(shù)量并不重視。隨著科學(xué)研究的逐步深入，人們開始考慮用PCR技術(shù)來進(jìn)行DNA或RNA的定量檢測，隨之出現(xiàn)了定量PCR（quantitative PCR，Q-PCR）技術(shù)這一新名詞。目前常用的Q-PCR技術(shù)可分為終點(diǎn)法和實(shí)時(shí)法。

3）多重PCR

多重PCR（multiplex PCR）即在同一反應(yīng)體系中加入多對引物，以同時(shí)擴(kuò)增一份DNA樣品中多個(gè)不同序列的靶片段。多對引物間的組合必須滿足二個(gè)條件，一是將反應(yīng)條件較為接近的引物組合在一起，以使該反應(yīng)條件能盡量適合所有被擴(kuò)增片段，二是同一反應(yīng)內(nèi)各擴(kuò)增片段的大小應(yīng)不同，以便檢測時(shí)能通過電泳將各片段分離開。多重PCR比較適用于被檢測基因較大，突變點(diǎn)較多的基因。

4）差異顯示PCR
差異顯示PCR（differential display PCR，DD-PCR）是一種以逆轉(zhuǎn)錄PCR為基礎(chǔ)的研究基因表達(dá)差異的技術(shù)。基因在不同組織細(xì)胞中的表達(dá)不同，在細(xì)胞的不同發(fā)育階段和狀態(tài)中的表達(dá)也有差異。研究基因表達(dá)譜的變化有助于理解細(xì)胞分化、增殖、細(xì)胞周期的調(diào)節(jié)和細(xì)胞衰老、凋亡的過程。

5）原位PCR

原位PCR（in situ PCR）是指組織固定處理細(xì)胞內(nèi)的DNA或RNA，并以其作為靶序列進(jìn)行PCR反應(yīng)的過程。原位PCR與普通PCR的主要區(qū)別在于模板的制備。經(jīng)脫蠟處理的組織切片或細(xì)胞懸液均可作為擴(kuò)增樣品，所有反應(yīng)在載玻片上進(jìn)行。原位PCR技術(shù)不僅不需要從組織細(xì)胞中分離模板DNA或RNA，而且能在細(xì)胞原位進(jìn)行PCR擴(kuò)增，大大地提高了檢測的靈敏度。目前，原位PCR已成為研究靶基因序列的細(xì)胞定位、組織分布和基因表達(dá)檢測的重要手段。

（4）基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)又稱DNA微陣列（DNA - chip）。該技術(shù)是二十一世紀(jì)生命科學(xué)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的一項(xiàng)快速的分子生物學(xué)技術(shù)。DNA-chip是將大量以特定排列方式的基因探針或基因片段固定于硅片、玻片和塑料片上，樣品DNA或RNA通過PCR擴(kuò)增，體外轉(zhuǎn)錄等技術(shù)摻入熒光標(biāo)記分子，與微陣列雜交后再通過熒光掃描儀及計(jì)算機(jī)分析，即可獲得樣品大量基因序列及表達(dá)信息。目前，基因芯片技術(shù)主要應(yīng)用于白血病的免疫分型、細(xì)胞的基因表達(dá)檢測、基因異常檢測及單核苷酸多態(tài)分析等。

（5）分子生物學(xué)檢查在血液學(xué)中的應(yīng)用

1）惡性血液病融合基因的檢測

白血病染色體相互易位是導(dǎo)致染色體重排的zui常見原因。染色體重排在分子水平上常形成融合基因。重組產(chǎn)生的融合基因及其融合蛋白是疾病的特異性分子標(biāo)志。融合基因檢測對疾病的診斷、分型、治療方案的選擇、預(yù)后判斷及微小殘留病的檢測都有重要的意義。
慢性粒細(xì)胞白血病（CML）Ph 染色體易位的后果是使位于9q34上的ABL原癌基因易位至22q11的BCR基因上，形成BCR-ABL融合基因，表達(dá)一個(gè)具有高*激酶活性的BCR-ABL融合蛋白，后者是CML發(fā)病的分子基礎(chǔ)。
急性早幼粒細(xì)胞白血病（APL）特異性染色體易位是t（15；17）（q22；q21），易位的結(jié)果使15號染色體的PML原癌基因與17號染色體上的維甲酸受體a（RARa）基因融合產(chǎn)生PML-RARa融合基因。臨床上變異型APL（M3v，M3b）與急性粒細(xì)胞白血病部分分化型（M2）較難鑒別，M2的t（8；21）可產(chǎn)生一種融合基因AML1-ETO，這種融合基因在M2中的發(fā)生率為20％-40％，在M2b中可達(dá)90％，通過融合基因的檢測可準(zhǔn)確鑒別這兩種白血病。融合基因的檢測對治療方案的選擇有明確的指導(dǎo)作用，在ATRA和*達(dá)*緩解（CR）的M3，PML-RARa融合基因陽性者極易在十個(gè)月內(nèi)復(fù)發(fā)，而融合基因陰性者，復(fù)發(fā)率低。

2）免疫球蛋白重鏈（IgH）基因和T細(xì)胞受體（TCR）基因重排的檢測　IgH和TCR的編碼基因具有多態(tài)性。IgH基因重排是產(chǎn)生個(gè)體多樣性和*性的主要原因。由于白血病細(xì)胞源于造血干細(xì)胞，所以白血病細(xì)胞是單克隆性的。用PCR方法對重排基因進(jìn)行擴(kuò)增，正常白細(xì)胞的擴(kuò)增產(chǎn)物大小不等，呈模糊的階梯狀，而白血病細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后條帶是單一的。約80%的B淋巴細(xì)胞白血病可檢測到IgH基因重排。通過PCR方法檢測IgH和TCR基因重排，有助于急性淋巴細(xì)胞白血病的分型以及微量殘留的檢測。

3）遺傳性血液病的診斷　血紅蛋白病是常見的遺傳性溶血性疾病，血友病是常見的遺傳性出血性疾病。基因缺陷包括基因缺失、點(diǎn)突變、插入、倒位等。對于基因重排，可通過RT-PCR進(jìn)行檢測；對于點(diǎn)突變則可用PCR結(jié)合酶切位點(diǎn)分析，即當(dāng)點(diǎn)突變使某一酶切位點(diǎn)消失或在某一區(qū)域出現(xiàn)新的酶切位點(diǎn)時(shí)，可用該酶切點(diǎn)兩側(cè)的引物進(jìn)行擴(kuò)增，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物用適當(dāng)?shù)膬?nèi)切酶切割，根據(jù)電泳圖譜來判斷有無內(nèi)切酶切點(diǎn)的改變。對于與限制性內(nèi)切酶點(diǎn)無連鎖的點(diǎn)突變，則可采用PCR結(jié)合特異寡核苷酸探針（ASO）斑點(diǎn)雜交法進(jìn)行診斷。

4）HLA基因多態(tài)性檢測　采用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的反相雜交（斑點(diǎn)雜交）進(jìn)行HLA基因多態(tài)性檢測十分簡便、有效。將每個(gè)位點(diǎn)的所有寡核苷酸探針固定在固相支持物上，引物先經(jīng)*化后，進(jìn)行待測DNA的基因擴(kuò)增，從而得到*化的DNA放大產(chǎn)物。用此產(chǎn)物與膜上的探針雜交，然后進(jìn)行顯色或化學(xué)發(fā)光。這樣每個(gè)樣本只需雜交一次即可完成。此方法適合骨髓移植的HLA基因配型及HLA基因與疾病相關(guān)性分析等。

5）腫瘤細(xì)胞多藥耐藥基因的檢測　多藥耐藥性（multidrug 　resistance,　MDR）是指腫瘤細(xì)胞接觸了一種藥物以后，不但對該藥產(chǎn)生耐藥性，而且對其他結(jié)構(gòu)的作用機(jī)制不同的藥物也產(chǎn)生耐藥性。研究發(fā)現(xiàn)，MDR的出現(xiàn)常與多藥耐藥基因（MDR1）過度表達(dá)有關(guān)，目前已建立Northern印跡法、斑點(diǎn)和狹縫印跡法、RT-PCR法及原位雜交法，從mRNA水平對患者進(jìn)行測定，了解腫瘤細(xì)胞的耐藥特性。有研究表明，急性髓細(xì)胞白血病MDR1的表達(dá)與預(yù)后有密切相關(guān)，即MDR1陽性者CR率低，生存期短，且易早期復(fù)發(fā)。

6）基因治療　基因治療的目的是應(yīng)用DNA重組技術(shù)和基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，把野生型的基因?qū)牖颊唧w細(xì)胞內(nèi)，成為正常的基因產(chǎn)物，來補(bǔ)償缺陷基因的功能，從而使疾病得到糾正。目前認(rèn)為基因治療的靶細(xì)胞是造血干細(xì)胞或間質(zhì)干細(xì)胞等。常用的載體是逆轉(zhuǎn)錄病毒和腺病毒。采用含人因子Ⅸ基因逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)染血友病B患者的原代皮膚成纖維細(xì)胞，使其表達(dá)一定濃度的因子Ⅸ，這將為血友病B治療提供新的方法。