等度（流動相組成不變）

等度優化的一般方法是不斷改變流動相強度（%B），直到獲得適當的保留范圍。這種方法有時也稱為“溶劑篩查"。對于簡單的分離，k 值應在 1 到 10 之間。如果 k 值太低（比如，< 1），早洗脫的色譜峰可能不發生保留峰或融入基質組分，因此對其進行定量將非常困難而且不可重復。另外，低 k 值峰受柱外效應影響很大，可能會使峰展寬。如果 k 值太大（比如，> 10），分析時間將變得過長，檢測限會因峰展寬而提高。

對于反相色譜中的等度方法開發是從流動相有機改性劑比例開始，然后逐漸降低。在降低流動相強度之前，先要確定所有組分都已從柱中洗出。如果組分保留在色譜柱中，以后可能在 B 相比例較低的流動相中洗脫，成為無法解釋的“鬼峰"。通常，流動相以 +/-10%（如，90% B、80% B、70% B 等）或 +/-20% 的幅度改變。利用一些現代軟件（如，ChromSword 的 ChromSword，ACD 的 AutoChrom），顯示保留變化曲線，系統進行自動調節，更快得到優化條件。當接近等度條件時，進行手動調節，幅度應減為 5% 或 3%。

請注意，如果流動相“A"中含高濃度緩沖液（比如，大于 25 mM），則不能使用 99% 的 B，因為當兩種溶劑系統開始混合，隨著 B 相百分比的減少，可能發生沉淀。一旦建立優化條件，如果目標還沒有得到分離，則需繼續提高選擇性 (α)。如需分離兩個相鄰的色譜峰會涉及到許多實驗參數的調節。溫度可以作為一個變量。大多數現代儀器都具有某種類型的柱溫控制器，大部分反相柱可以承受高達 60 ℃ 的溫度，有些甚至更高。一般來說，升高溫度可以縮短所有峰的保留時間，但對有些峰的影響可能與對其它峰不同，從而導致選擇性發生變化。

其它用于改變選擇性的變量如下：

1. pH（對于可離子化的化合物）

2. 緩沖液（離子）強度

3. 緩沖液類型（比如，磷酸鹽、醋酸鹽或甲酸鹽，取決于需要的 pH 范圍）

4. 流動相有機改性劑（比如，從乙腈變為甲醇或兩者的混合液；可使用三元和四元流動相混合溶劑）

5. 流速（一般而言，由于提高了柱效，較低的流速可能對分離略有改善，但也有例外——見下面的提示）

6. 離子對試劑濃度（如果使用離子對 RPC）

如果調節這些參數還不能改善分離，那么解決辦法就是改變色譜柱或固定相。更長的色譜柱具有更多塔板數，因此有助于分離，但切記，分離度只能增加長度的平方根。柱長加倍使分析時間和溶劑消耗加倍，而靈敏度降低，但只能使分離度提高約 40%。改用較小粒度色譜柱也能增加塔板數，但柱壓上升 。使用新的固定相（如 C18 換成苯基柱）需要進行一套新的溶劑篩選實驗，耗費更多時間，但可能得到的分離結果。但需要額外購買具有不同固定相的反相柱。

梯度（流動相強度隨時間變化）

對于含各種組分的樣品混合物來說，選擇單動相組分可能得不到滿意的解決方案（比如，一般洗脫問題）。例如，某些樣品組分，如強極性分析物，可能很快從反相柱上被洗脫下來，而疏水性組分可能在疏水性的 C8 或 C18 上吸附非常強，洗脫不下來。對這一問題的解決方案是隨時間改變流動相組成（梯度洗脫）。在絕大多數例子中，初始流動相非常弱（比如，含水量高），隨時間的推移，有機溶劑的百分比通常是以線性形式增加。

兩種情況下要使用梯度洗脫的方法開發過程。一種是用梯度預測反相分離的起始等度條件。大多數方法開發軟件（如，DryLab、ChromSword、AutoChrom）都具有這項功能，最少進行兩次梯度分離，然后預測出等度條件。接下來就可以用這些條件進一步進行等度分離優化了。

第二種情況是開發梯度方法，并使用了寬范圍的快速梯度（比如，10 分鐘內 B 由 5% 變到 95%），確定目標化合物的梯度范圍。實際上，某些軟件系統可以通過色譜數據系統/控制器之間的相互作用來設置梯度，對分離進行優化。但是，手動操作也可以完成同樣的工作，找到目標峰洗脫的流動相比例，然后通過下一次梯度，調節 k*（梯度等于 k）范圍，讓梯度分離在合理的時間內完成。

然后，與等度優化一樣，當分離時間合理后進行選擇性的確定。

HILIC色譜柱

親水相互作用液相色譜 (HILIC) – 有時也被稱為“水相正相"(ANP) – 是一項已發展了數十年的技術。由于這項技術能夠對反相柱上不保留或保留較差的極性化合物進行分析，近年來又重新受到了重視。而且，這項技術很容易與 MS 和 MS-MS 檢測技術兼容。當 HILIC 分離使用高有機相流動相時，與水相緩沖系統相比由于具有較低的離子抑制，從而提高了 MS 靈敏度。

HILIC 使用極性固定相，如硅膠、氨基、混合模式、兩性離子等，以及水溶性的、非極性流動相，由少量水（至少 2.5% 體積比）和高比例有機相組成。

在 HILIC 方法中，親水、極性和帶電荷化合物比疏水、中性化合物更容易保留。與反相液相色譜相反。

在流動相中加水會降低保留。HILIC 與正相色譜相比，能得到強極性溶質的良好峰形。是反相色譜的補充方法，由于保留了親水性化合物，因此常使洗脫順序倒置。

正相色譜

正相或吸附色譜的出現早于反相色譜。“正"的叫法源自其原本概念，即，固定相為極性、流動相為非極性、極性化合物保留更強。

在正相色譜中，使用硅膠或另一種極性固定相，如短鏈氨基或二醇。流動相為非極性——通常為烴類、二氯甲烷、乙酸乙酯，或另一種水溶性的溶劑。在正相色譜中，極性組分保留更強。隨流動相極性增大極性組分保留減弱。使用的流動相極性越強，分析物的洗脫越快。在硅膠柱上進行正相梯度分離時，可以從己烷等非極性溶劑開始，然后逐漸加入極性溶劑，如乙酸乙酯，比如，乙酸乙酯從 5% 到 95%。根據目標物的洗脫位置，可以調節梯度以改善所有組分的分離。有時加入一定量的水或少量異丙醇，可以調節硅膠填料的表面活性。鍵合相色譜柱可能不需要水的存在，并常使用醇類作為改性劑。

我們使用正相色譜的原因之一是使更多的極性化合物得到保留。也可以用這種模式洗脫在反相色譜中高度保留的疏水化合物。

正相色譜有許多用途。適合分離幾何異構體和位置異構體。可得到比反相色譜更高的分辨率。當我們沒有水溶性的溶劑時，可以使用正相色譜。也可以用于制備分離，流動相不含水，易于蒸發。

總結：正相

? 柱填料為極性：硅膠（）>氨基>二醇>氰基（最弱）

? 流動相為非極性：己烷、異辛烷、二氯甲烷、乙酸乙酯等

? 極性化合物保留更強

? 隨流動相極性增大保留減弱

選擇正相的目的：

? 分離高度保留的疏水樣品

? 分離異構體

? 樣品進樣溶劑為非極性和/或非水溶性的

? 使用非極性溶劑進行回收

離子交換色譜

離子交換色譜可以分離離子型化合物和可離子化的化合物。在這種模式中，我們使用帶有離子型官能團的填料，其所帶電荷與分析物相反。在強陽離子交換 (SCX) 色譜中，我們要分析帶正電荷的分子或陽離子，因此使用的是陰離子型或帶負電荷的固定相。如果我們要分析帶負電荷的分子或陰離子，應使用陽離子型或帶正電荷的固定相。

在離子交換色譜中，流動相通常含水量較高，并含有緩沖液或鹽。通過連續或階梯梯度增加離子強度（鹽濃度）進行洗脫。常用于對生物大分子的分離，也用于小分子的分離，如氨基酸、無機陽離子和陰離子，以及氨類或羧酸等可離子化的化合物。

凝膠滲透色譜/體積排阻色譜

在 GPC/SEC 中，樣品分子與填料之間不存在相互作用，并通過擴散進入多孔聚合物基質或硅膠基質的孔隙中。根據分子的體積大小和相應填料孔隙大小進行分離。體積比填料孔隙大的分子不能擴散進入填料，而體積比填料孔隙小的分子則可以進入填料，因此樣品得到分離。與反相色譜不同的是，大分子先洗脫出來，小分子后洗脫出來。

通常，較大分子被排阻在孔隙之外，從而快速從色譜柱中洗脫出來，為排阻體積。最小的分子可以滲透入色譜柱的所有孔隙，最后洗脫出來，為滲透體積。其它所有分子在這兩者之間按分子大小洗脫出來。如果要測定單個組分的分子量 (MW) 或整體分布，需要先用已知分子量的標樣以洗脫體積對 log MW 建立校正曲線。然后，在與標樣相同的條件下分析聚合物樣品，即可測定該聚合物的分子量和分子量分布。

主要選用流動相溶解分析物。

GPC/SEC 小結：

? 兩種模式：非水相 GPC 和水相 SEC（也稱凝膠過濾色譜，或 GFC）

? 在體積排阻色譜中，樣品分子與填料之間無相互作用，并通過擴散進入多孔聚合物基質的孔隙中。根據分子的體積大小和相應填料孔隙大小進行分離。在不同溶劑或流動相中可能得到不同的流體動力學半徑。

? 主要選用流動相溶解分析物

? 主要用于聚合物表征、聚合物分子量測定和蛋白質分離

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